熒光顯微鏡是以紫外線為光源， 用以照射被檢物體， 使之發(fā)出熒光， 然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運輸、化學物質(zhì)的分布及定位等。 細胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光;另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進行定性和定量研究的工具之一。

（熒光顯微鏡原理圖）

　　濾色系統(tǒng)

　　濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號，各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號特點。如德國產(chǎn)品(Schott)BG12，就是種藍色玻璃，B是藍色的第一個字母，G是玻璃的第一個字母;我國產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當于BG12的藍色濾板名為QB24，Q是青色(藍色)拼音的第一個字母，B是玻璃拼音的第一個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530，就是表示壓制濾長 530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數(shù)字命名，如美國Corning廠的NO：5-58，即相當于BG12。

　　1.激發(fā)濾板 根據(jù)光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發(fā)濾板，提供一定波長范圍的激發(fā)光。

　　紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。

　　紫外藍光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。

　　紫藍光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24(BG12)。

　　最大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達明色素)可用藍綠濾板(如B-7)激發(fā)。

　　開始采用金屬膜干涉濾板，由于針對性強，波長適當，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達明的S546綠色濾板，均遠比玻璃濾板效果好。

　　激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些?；疽笫且垣@得最明亮的熒光和最好的背景為準。

　　2.壓制濾板 壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過，提供相應波長范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對應，常用以下3種壓制濾板：

　　紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。

　　紫藍光壓制濾板：能通過510nm以上波長的光(綠到紅)，能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。

　　紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長的光(藍到紅)，可與BG-3組合，常用OG-11K470AK 490，K510。

　　反光鏡

　　反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍紫區(qū)吸收少，反射達90%以上，而銀的反射只有70%;一般使用平面反光鏡。

　　聚光鏡

　　專為熒光顯微鏡設(shè)計制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。

　　1.明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適于低、中倍放大的標本觀察。

　　2.暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應用日益廣泛。因為激發(fā)光不直接進入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強激發(fā)光的強度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時，可用無色濾板(不透過紫外)而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀察舒適，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細微熒光顆粒。

　　3.相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時進行相差和熒光聯(lián)合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。

　　物鏡

　　各種物鏡均可應用，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能(波長范圍)適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時其影響非常明顯。因此對熒光不夠強的標本，應使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡(4×,5×，6.3×等)。

　　目鏡

　　在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。

　　落射光裝置

　　新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后，波長短的部分(紫外和紫藍)由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當濾鏡對向光源呈45。傾斜時，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標本，使標本受到激發(fā)，這時物鏡直接起聚光器的作用。同時，濾長長的部分(綠、黃、紅等)，對濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用，由于標本的熒光處在可見光長波區(qū)，可透過濾鏡而到達目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高，在高放大時比透射光源強。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標本等的直接觀察。研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱之為落射熒光顯微鏡。